Wie zu Tun

Setup und Lesen

Schritt 1

Generieren oder bereiten Fusion Konstrukte jedes Protein des Interesses, wobei jeweils an einem Fluoreszenz-bertragung Molekl wie grn fluoreszierende Protein gebunden (GFP), Rhodamin oder Bor-Dipyrromethen (BODIPY).

Schritt 2

Bestimmen Absorption und Emission Wellenlngen der einzelnen fluoreszierenden Komponenten und des gesamten Tests. (Zum Beispiel, wenn der Assay misst GFP -

Schritt 3

Erstellen Sie geeignete Reaktionspuffer fr das Experiment, abhngig von der Proteine des Interesses der biochemischen Eigenschaften. Ein TRIS-basierten Pufferberlauf wird hufig verwendet, einschlielich Calciumchlorid und 0,05 Prozent Tween-20. Besondere Konzentrationen und Komponenten knnen bei der Suche nach Journaleintrge Detaillierung hnliche Reaktionen und Bedingungen festgelegt werden.

Schritt 4

Mischen Sie die beiden Reporter-konjugierten Proteine von Interesse in verschiedenen Konzentrationen im Reaktionspuffer und Aliquot von 50 bis 200 ul pro Well. Schreibe eine Konjugation Enzym (z. B. Sortase) zu jeder Probe sowie gegebenenfalls. Wenn die Durchfhrung Endpunkt-Assay, ermglichen Inkubation bei Raumtemperatur (oder Enzyms optimale Temperatur) fr einen bestimmten Zeitraum, dann auf 96-Well-Platte Reader zu lesen. Wenn die Durchfhrung einer Kinetik-Assay, gehen Sie direkt zu lesen (siehe unten).

Schritt 5

Legen Probenteller in 96-Well-Platte Leser. Erstellen Sie ein neues Experiment Seite und Zugriff auf die Einstellungen im Men. Eingang der berichtigten Absorption (Erregung) und Emissionswellenlnge, whlen Sie dann die entsprechenden Vertiefungen zu lesen sein. Wenn die Durchfhrung einer Kinetik-Experiment, setzen Sie die Zeit-Verlauf des Experiments und die Lesungen Intervall Zeitraum (z. B. einmal alle 10 Minuten). Begin Lesung sample.Analyze Daten mit Microsoft Excel Grafik-Funktion (oder einer anderen Grafik-Programm wie GraphPad).